精彩回顾 | 可溶性生物标志物的生物分析考量

Cronk医学博士以其近20多年在PK、生物分析方法开发与验证、免疫原性和生物标志物等经验为大家分享可溶性蛋白质靶点的生物检测相关知识。

2023年10月11日19:30，安渡生物生物分析副主管研究员在安渡生物Live平台进行以《可溶性生物标志物的生物分析考量》为主题以直播的形式做报告。本文将以文字的形式与大家分享报告的主要内容，如您希望观看视频亦可点击下方图片回看。以下，Enjoy

Cronk医学博士以其近20多年在PK、生物分析方法开发与验证、免疫原性和生物标志物等经验为大家分享可溶性蛋白质靶点的生物检测相关知识。

本期Cronk博士主要从分子生物标记物定量检测和“Context of Use”的概念、药物可溶性蛋白质靶点及其生物分析的重要性、可溶性蛋白质靶点生物标志物Ligand Binding Assay 研发的策略，同时她也将从生物科学家的角度介绍PK-PD模型。

分子生物标记物定量检测

和“Context of Use”的概念

Cronk博士首先介绍生物标志物检测的关键概念和特定用途，并根据用途对生物标志物进行分类。

由于生物标志物的复杂性和多样性，支持药物研发的生物标志物检测目前没有统一的法规和建议。2006年美国药物科学家协会提出了合适于特定用途的生物标志物方法验证的概念：生物标志物的方法验证必须要根据数据的需要和特定的目的来确定生物标志物方法。近年来，’适合背景‘（COU）取代了FIT FOR PURPOSE，生物标志物的方法验证需要根据具体的需要来而定。这对生物分析科学家提出了更高的要求，需要对药物的机制、临床试验深入了解，也需要和药物研发的科学家，药剂科学家和临床试验医生更多的交流，真正了解生物标志物检测的目的和用途。

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药物可溶性蛋白质靶点

及其生物分析的重要性

Cronk博士介绍了以可溶性配体作为药物靶点的药物研发进展，其中治疗性抗体药物最常见。随着可溶性配体作为靶点药物的增加，可溶性靶点的检测也变得越来越全面。由此，她概述了可溶性蛋白质靶点和生物标志物及其生物分析的重要性。

以可溶性配体作为药物靶点的药物研发进展

传统药物的作用靶点包括：膜受体，酶，离子通道，和跨膜转运子。近20-30年来，大多数新药的研发开始选用血循环中可溶性配体作为药物作用的靶点。在一篇2020年的一篇综述（书）中总结了90年代到2020年6月所有的以可溶性配体为靶点的药物。这些药物选择的可溶性配体主要有细胞因子和生长因子。其中36个以可溶性配体为靶点的药物已经被FDA批准，更多的药物已经进入I，II, 和III期临床实验中。

这些药物主要用于治疗包括炎症和自主免疫性疾病，癌症，眼科疾病以及骨质疏松。

在这些以可溶性配体为治疗靶点的药物中，治疗性抗体类药物最常见，将近有200个抗体类药物。其他药物类别还有decoy receptor，寡核苷酸，抗体片段，治疗性疫苗，抗体模拟物，aptamer，纳米抗体，基因治疗等

随着以可溶性配体作为靶点的治疗药物的增加，可溶性生物标志物的检测也越来变常见。可溶性靶点生物标志物的检测可以用于：

证实生物药物和靶点的结合
评估药物和靶点的相互依赖关系
监测药物对疾病进程的影响，确定药物的临床结果和生物标志物之间的联系，这对那些首创药物特别有用。
确定药物对靶点作用的最佳时间段和重复给药的方案
监测由于药物免疫源性导致的药物失效

可溶性蛋白质靶点生物标志物

Ligand Binding Assay 研发的策略

Cronk博士在直播中重点阐述了可溶性蛋白质靶点生物标志物配体结合分析方法研发的策略。可溶性生物标志物检测可以作为药物研发中一个重要工具，但我们依然面临很多挑战。

可溶性靶点生物标志物有两种形式，一种是结合型，一种是游离型。我们需要用不同结合试剂检测结合型和游离型的可溶性靶点，另外样本中的很多别的成分也会对可溶性靶点检测造成干扰，除了这两个因素外，其他的挑战还有：

可溶性靶点的浓度通常很低，所以检测方法的敏感性要求很高。
可溶性配体靶点是内源性蛋白，检测的标准品一般会选用重组蛋白而不是内源性的可溶性配体。
可溶性靶点是内源性蛋白，空白基质很难得到，检测用的标准品一般会使用替代基质，由于检测标准品和标准品基质和检测样本中的可溶性靶点和样本基质不同，给检测带来一定的困难。
除了药物本身以外，样本中的抗药物抗体，以及可溶性受体会干扰可溶性靶点的检测。
另外可溶性靶点和生物药物相比，更不稳定，这也增加检测困难。
目前还没有生物标志物检测指南，生物分析科学家要根据 Context of Use 的原则进行方法研发和验证。所以我们生物科学家必须清楚了解生物标志物的生物学知识，生物标志物检测的目的以及相关的临床研究。

在选择LBA检测技术平台时，需要根据不同药物靶点的需要和检测的目的进行选择，没有一个统一的方法，据此，Cronk博士列举了不同平台的优缺点，帮助大家更好去选择Ligand Binding Assay 检测技术平台。

怎样选择Ligand Binding Assay 检测技术平台

在选择LBA检测技术平台时，必须要根据不同的药物靶点的需要和检测的目的进行选择。没有统一的方法。

传统的酶联免疫吸附法还是最常用的方法。它的优点是方法成熟，便宜，仪器和试剂要求相对较低，大部分实验室都可使用。它的缺点是敏感性低，检测范围窄，耗时耗力。

电化学发光法技术成熟，相对比较敏感，检测范围比较大，因此需要的样本量相对较低。它缺点是供应商少，目前只有一家。

Gyrolab 是一种半自动的仪器，它需要的样本量很少，所以适合于研究对象是儿童的临床试验。它缺点是仪器贵，可能出现交叉污染的情况。

近年来出现一些新技术平台包括Singulex, 它的有点优点是敏感性好，检测范围大，但没有广泛应用。

如何检测游离可溶性靶点

检测游离可溶性靶点最大的优点是可以直接检测给药后药物对游离靶点的抑制，但存在很多挑战：1）可溶性靶点的浓度很低，ligand binding assay 难达到这种敏感性。2) 给药后靶点和药物结合后，由于稳定性增加，造成治疗后可溶性靶点在血循环中浓度明显增加。药物和靶点的结合是一个动态平衡，在靶点浓度增加时，这种动态平衡就倾向于分解，这可能会导致检测的游离量会高于实际的游离靶点水平。3)样本的稀释，检测时各种条件的变化也可能导致抗体和抗原的动态平衡破坏，造成游离靶点的不准确的测量。

用ligand binding assay检测游离靶点时，需要用capture 抗体，必须能够识别靶点上和药物结合同一位点。

总靶点的检测

总靶点检测是要检测游离型和结合型靶点总和，检测总靶点的优点是药物和靶点的动态平衡对检测的影响少。它主要的缺点是不容易找到检测的结合试剂，检测试剂必须是能够结合到与药物结合的不同位点上，这样就不会和药物产生竞争性结合。

另一个缺点是总靶点的检测不能直接测量治疗后游离靶点的减少，而需要药代动力学和药效学模型进行计算。

如何测量总靶点？

最理想的情况是找到一对与药物没有竞争的capture和detection抗体，由于capture和detection抗体结合的位点与药物结合的位点不同，能同时检测到结合型和游离型的靶点。
如果抗体类药物干扰靶点的检测，可以用酸碱处理样本，酸碱会抗体类的药物和靶点的结合，而靶点分子量比较小，和capture和detection抗体的结合力会恢复。但这种方法不广泛适用。
如果只能找到一个非竞争性检测抗体，可以在样本中加过量的药物让所有的游离靶点变成结合性靶点，再使用检测药物的二抗作为detection抗体。

从生物科学家的角度介绍PK-PD模型

最后，Cronk博士总结：做为生物分析科学家，一定要明白我们研发的方法检测到的是什么，是游离靶点还是总靶点。作为生物分析科学家，我们必须要清楚把这个信息传达给药剂科学家，这样药剂科学家的才能根据我们数据建立可靠的PK-PD模型中，我们最终目的是帮助临床试验得出可靠的结论和判断

安渡生物首席科学官兼定量临床药理总裁Lorin Roskos博士和首席技术官兼生物分析与生物标志物总裁梁美娜博士在2011年发表的关于可溶性生物标志物检测以及如何建立和应用PK-PD模型的文章，对今天的内容帮助很大。

专家介绍

Zhumei Cronk 博士

安渡生物

生物分析副主管研究员

近20年行业经验（美国弗吉尼亚联邦大学、HDL、PPD）
在PK、生物分析方法开发与验证、免疫原性和生物标志物等方面拥有丰富经验
中南大学湘雅医学院博士和医学博士，美国弗吉尼亚联邦大学生物化学和免疫学博士后

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